植物防疫関連資材 技術情報

◆DAS-ELISA法(二重抗体サンドイッチ法)

■植物ウイルスに対して検定する場合の一般例

1.準備するもの(材料)
  1. 器具
    マイクロタイタープレート(96穴),ポリ洗浄瓶(プレート洗浄用),マイクロピペット(20μl~200μl用),マイクロチップ(20μl~ 200μl用),ラップフィルムおよびポリ容器(プレート乾燥防止用),ペーパータオル(洗浄時使用)
  2. 緩衝液・試薬および培地
    DAS-ELISA用コーティング液(IgG),DAS-ELISA用コンジュゲート液(IgG+アルカリフォスファターゼラベル)0.05M カーボネート緩衝液(pH9.6),0.02M リン酸緩衝生理食塩水液(pH7.4) [PBS],PBS+Tween 20 [PBS-T] ,10%ジエタノールアミン溶液(pH9.8),P-ニトロフェニルリン酸2ナトリウム(発色剤,粉末),1N 塩酸(pH調整用)
  3. その他
    マイクロプレートリーダー(吸光値測定用),冷蔵庫(4~10℃,プレート保管用),恒温器(37℃常温,抗体吸着,インキュベーション用)

2.検定手順
  1. コーティング液をカーボネート緩衝液で所定濃度に希釈し,マイクロプレートの各穴に200μlずつ分注する。(コーティング処理)
  2. マイクロプレートをラップフィルム等で包み,37℃で3時間あるいは冷温(4℃)で1晩静置する。
  3. PBS-Tを磨砕液として調整した上清を検定試料として,各2穴に200μlずつ分注する。(試料処理)
  4. ラップフィルム等で包んだマイクロプレートを37℃で2時間あるいは冷温(4℃)で1晩静置する。
  5. コンジュゲート液をPBS-Tで所定濃度に希釈し,マイクロプレートの各穴に200μlずつ分注する。(コンジュゲート処理)
  6. ラップフィルム等で包んだマイクロプレートを37℃で3~4時間静置する。
  7. マイクロプレートをPBS-Tで4~5回洗浄する。
  8. 10%ジエタノールアミン溶液にP-ニトロフェニルリン酸2ナトリウム(1mg/ml)を溶解する。(基質溶液)
  9. 基質溶液を200μlずつ各穴に分注する。(基質添加)
  10. 基質添加から30分~60分後に結果判定(※)
    ※ 肉眼で発色(黄色)の有無を確認する。その時,ネガティブコントロールが無発色であり,陽性反応液が強く発色していることが条件となる。あるいはマイクロプレートリーダーで吸光度を測定してより正確な判定を行う。

■公表された主な研究報告(血清診断法)